Analysis of signalling pathways required for hemocyte navigation in Drosphila

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A migração celular é um fenómeno fundamental e altamente regulado, que desempenha um papel activo numa grande variedade de processos biológicos. Por exemplo, é essencial para os processos de gastrulação e organogénese durante o desenvolvimento embrionário e, também, para o estabelecimento e manutenção da homeostasia do organismo durante a vida adulta, onde participa na reparação de feridas e na migração de células imunitárias para locais de inflamação. Falhas nos mecanismos de migração celular podem originar diversas patologias, tais como inflamações crónicas, defeitos congénitos e metastização de tumores. Os processos que permitem a migração celular despertam, por isso, grande interesse do ponto de vista terapêutico. O mecanismo de migração celular direccionada, também designado por quimiotaxia, tem sido principalmente analisado através de estudos em cultura de células imunitárias de mamífero. Estes estudos identificaram vários estímulos quimiotácticos, receptores celulares e vias de sinalização essenciais para a migração celular. Alguns destes estímulos quimiotácticos são compostos por moléculas difusíveis designadas por quimiocinas. Estas moléculas são reconhecidas por receptores que se encontram à superfície dos leucócitos, e que fazem parte de uma vasta família de receptores celulares, os receptores associados a proteínas G ou “G-protein coupled receptors” (GPCRs). Estes promovem respostas por parte da célula através de proteínas a eles associadas, as proteínas G ou “G-proteins”. Outros tipos de estímulos quimiotácticos, tais como factores de crescimento, tem a capacidade de activar outra classe de receptores, os receptores tirosina-cinase ou “receptor tyrosine kinases” (RTKs), que são também importantes na promoção de migração celular. A activação destes receptores leva ao recrutamento de moléculas sinalizadoras, nomeadamente a cinase de fosfatidilinositol (PI3K), importante para o estabelecimento da polaridade celular necessária para a migração celular. Embora estes estudos em culturas celulares tenham contribuído bastante para o nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares da migração celular, pouco se sabe acerca da regulação destes mecanismos no contexto de um organismo. É, portanto, fundamental o recurso a um modelo animal simples, e ao mesmo tempo relevante, para analisar estes processos. As células imunitárias ou hemócitos de Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) partilham muitas características com os seus equivalentes nos mamíferos, tanto em termos de função (fagocitose de microrganismos invasores e de corpos apoptóticos, por exemplo), como no seu desenvolvimento hematopoiético (regulado por factores de transcrição das famílias GATA, RUNX, e friend-of-GATA). Em semelhança aos leucócitos, os hemócitos são expostos a uma elevada variedade de estímulos quimiotácticos que têm de ser integrados para definir a sua direcção de migração. Recentemente, os hemócitos embrionários têm sido utilizados como um excelente sistema para o estudo da migração celular e da inflamação in vivo. Estes estudos revelaram que os componentes moleculares que regulam a migração celular são muito semelhantes aos dos leucócitos. Em D. melanogaster existem receptores da familia dos GPCRs e RTKs que desempenham um papel na migração determinados tipos celulares. Um exemplo importante, é o receptor Pvr, um RTK, que é necessário à migração de hemócitos durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, a utilização de D. melanogaster como modelo de estudo permite tirar partido de tecnologias bastante avançadas e úteis como a microscopia confocal, e de vastas bibliotecas de mutantes e transgénicos. Outra vantagem é a utilização do sistema GAL4/UAS, que permite determinar a função e localização de diferentes moléculas especificamente nos tecidos e células em estudo e no estádio de desenvolvimento relevante. Assim, o objectivo deste projecto foi analisar o papel da cinase PI3K, dos GPCRs e dos RTKs no recrutamento de hemócitos para localizações específicas, durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Neste estádio do desenvolvimento, uma parte dos hemócitos encontra-se associada a vários tecidos, nomeadamente, à região anterior do intestino designada “proventriculus” (PV) e ao epitélio dorsal, onde estas células se distribuem por grupos sésseis ao longo do eixo antero-posterior da larva, os “sessile patches” (SP). Em primeiro lugar, estudou-se a função da cinase PI3K através da expressão nos hemócitos de uma forma Dominante Negativa (DN) e de uma forma Constitutivamente Activa (CA) desta proteína. Enquanto a primeira bloqueia a acção de PI3K, a segunda mantém-la constantemente activada. Quando se expressou a forma DN de PI3K especificamente nos hemócitos, observou-se um aumento na população de hemócitos no PV, ao passo que nos SP foi observada uma diminuição no número destas células. O efeito da forma DN de PI3K na população de hemócitos do PV é semelhante aos resultados recentemente obtidos em modelos de ratinho para colite, o que demonstra alguma semelhança entre estes dois modelos. Por outro lado, o fenómeno oposto foi detectado após a expressão da forma CA de PI3K. Isto é, quando constitutivamente activa, a cinase PI3K leva à diminuição do número de hemócitos no PV e ao seu aumento nos SP. Verificou-se ainda que as alterações no número de hemócitos são independentes de um potencial efeito da cinase PI3K na proliferação e apoptose destas células, confirmado através da utilização de imunomarcação com o anticorpo anti-fosfo histona H3 e da técnica de TUNEL. Estes resultados revelam que a cinase PI3K poderá ter um papel na regulação da migração de hemócitos em ambas regiões da larva mas a diferentes níveis. Para além disso, verificou-se que a modulação dos níveis de activação de PI3K leva a alterações na morfologia e propriedades adesivas dos hemócitos, o que indica que PI3K também pode ter um papel na regulação das propriedades adesivas destas células. Resumindo, a cinase PI3K parece ser necessária para o controlo e manutenção do tamanho destas populações de hemócitos possivelmente através da regulação da sua migração e/ou adesão aos tecidos adjacentes. Para analisar o papel de receptores envolvidos no recrutamento e na manutenção destas populações de hemócitos, preferencialmente a montante da cinase PI3K, efectuou-se um rastreio genético baseado na utilização de RNAi para silenciar a expressão de potenciais candidatos. Uma vez que existem cerca de 270 GPCRs e 21 RTKs em D. melanogaster, optou-se por se estudar apenas RTKs e GPCRs (e suas proteínas G associadas) que se sabe serem expressos nos hemócitos. Através deste rastreio genético foi possível identificar vários genes com diferentes funções na migração e/ou manutenção das populações de hemócitos: GRHR, btl, Pvr, e GRHRII. GRHR é um GPCR que parece ser importante para a homeostasia dos hemócitos. Blt é um RTK que poderá ser necessário para a regulação negativa do número de hemócitos nos SP. Pvr é também um RTK que poderá desempenhar uma função homeostática, mas ao mesmo tempo ser necessário para a migração dos hemócitos para o PV e SP, uma vez que se observou uma diminuição no número de hemócitos em ambas as localizações quando silenciada a sua expressão. Finalmente, identificou-se o gene GRHRII, que poderá funcionar a montante da cinase PI3K, uma vez que a expressão de RNAi contra este receptor provocou um efeito semelhante ao observado através da expressão da forma DN de PI3K. Dos quatro candidatos identificados, Pvr e GHRHII parecem ser os receptores mais relevantes. Sendo estes resultados preliminares, a próxima etapa deste projecto será validar os fenótipos observados através de outros métodos de análise. Por exemplo, para confirmar a função destes genes pode recorrer-se à utilização de mutantes e a análises epistáticas para determinar se o gene GRHRII actua a montante da cinase PI3K. Em conclusão, estes resultados revelam o papel crucial de diferentes proteínas na regulação das populações de hemócitos durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Em particular a cinase PI3K, que poderá controlar o número de hemócitos através dois processos distintos: i) através da regulação da sua migração, e/ou ii) através da regulação das propriedades adesivas da célula. O rastreio genético realizado permitiu ainda identificar receptores que poderão estar envolvidos na regulação da migração dos hemócitos destas duas regiões, nomeadamente GRHRII e Pvr. De facto, GRHRII poderá funcionar a montante da cinase PI3K e ter um papel na regulação dos números de hemócitos do PV e dos SP. Estes resultados são especialmente interessantes. Se se confirmar o papel deste GPCR no recrutamento de hemócitos, esta será uma descoberta relevante em termos evolutivos, uma vez que demonstra, pela primeira vez, que, à semelhança do que ocorre em mamíferos, os GPCRs desempenham uma função na migração das células imunitárias em D. melanogaster. Estes resultados também apoiam a ideia de que estas células necessitam de integrar diferentes informações provenientes de regiões diferentes para definirem a sua direcção de migração. Desta forma, este estudo fornece novos conhecimentos acerca das vias de sinalização necessárias durante o recrutamento de hemócitos para regiões específicas durante a terceira fase larvar em D. melanogaster e de como estas populações são mantidas. Estes conhecimentos poderão representar um importante contributo para o estabelecimento dos hemócitos como modelos para o estudo de migração celular.Cell migration is an essential and highly regulated mechanism that plays a role in a wide variety of biological processes throughout an organism‟s life. The dysregulation of cell migration can lead to several pathologies such as chronic inflammatory diseases, congenital defects and tumour cell metastasis. Directed cell migration or chemotaxis has been intensively analyzed through cell culture studies, mainly utilizing mammalian immune cells. These models identified several guidance cues, receptors and signalling pathways important for migration of leukocytes to target tissues and to sites of inflammation and damaged epithelia. However, a simple but reliable in vivo system is needed to uncover the mechanisms underlying immune cell migration within the organism. Drosophila melanogaster hemocytes share many important similarities with their mammalian counterparts in terms of function and haematopoiesis. Embryonic hemocytes are an established model to study cell migration in vivo, due to their amenability to live imaging and the array of genetic techniques that allow for functional analysis of molecular processes in specific cell types. The aim of this project was to analyze the role of Phosphoinositide 3-kinase (PI3K), G Protein Coupled Receptors (GPCRs) and Receptor Tyrosine Kinases (RTKs) in hemocyte recruitment to specific tissue targets in Drosophila third instar larvae, namely the intestine and dorsal epithelium. Here we show that PI3K is important for regulating the size and maintenance of these tissue-associated hemocyte populations, possibly by regulating hemocyte response to external signals and/or by modifying their adhesive properties possibly through Cadherin regulation. In addition, in a candidate screen we identified two receptors, a GPCR and an RTK, potentially required for the recruitment and/or maintenance of hemocytes at these locations. In the future, these results could help to better understand innate immune cell migration and to further establish hemocytes as models for in vivo cell migration

Mechanisms of osteoblast reprogramming and differentiation during zebrafish caudal fin regeneration

Regeneration is an impressive biological process that allows the replacement of lost body parts due to damage or injury, restoring both tissue architecture and function. It is well documented that while mammals have a limited capacity to regenerate lost tissues, other vertebrates, such as amphibians and teleost fish, exhibit a remarkable capacity to regenerate organs, like the heart and the retina, and large sections of the body, such as the limb and the fin. Zebrafish has become an important model system to study vertebrate regeneration and the adult caudal fin is one of the most used tissues to comprehend how tissues are restored. This structure is easily accessible to surgery, amenable to live imaging, its amputation does not compromise survival and regeneration is particularly fast, occurring over the course of two weeks. Fin regeneration is an epimorphic process since it relies on a specialized structure called blastema, which is composed of a proliferative heterogeneous population of dedifferentiated cells with restrictive lineage potential. After caudal fin amputation, a regenerative program is activated and occurs in three sequential phases: wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth. These events comprise a tight coordination between proliferation, patterning and differentiation to reconstitute the architecture and the size of the original tissue. The adult caudal fin is composed of multiple tissues, including blood vessels, nerves, mesenchyme and the structural support, the bony-rays (skeletal elements). Each bony-ray is surrounded and maintained by an outer and inner monolayer of bone secreting cells, the osteoblasts. Many studies have focused on bone regeneration since the zebrafish caudal fin provides a unique model to understand bone formation and osteoblast dynamics upon tissue damage and regeneration. After caudal fin amputation, formation of the new bone elements depends greatly on tissue plasticity (changes in cellular identity). This is achieved through the activation of two complementary processes that enable the assembly of an osteoblast progenitor pool during blastema formation: dedifferentiation of resident mature osteoblasts and commitment of joint-associated osteoblast progenitors. Complex regulatory mechanisms subsequently maintain and expand the osteoblast progenitor pool and promote their redifferentiation into mature osteoblasts to restore the skeletal tissue. Therefore, both osteoblast progenitor assembly and redifferentiation are critical aspects of caudal fin bony-ray regeneration. Interestingly, ablation of mature osteoblasts prior to caudal fin amputation does not affect normal bone regeneration, suggesting that de novo bone formation can rely solely on the commitment of joint-associated osteoblast precursors or on new osteoblast progenitors arising from alternative sources.In this PhD thesis, I aimed to unravel key aspects of caudal fin bone regeneration, focusing on new regulators of osteoblast dedifferentiation and redifferentiation and alternative sources for de novo osteoblast formation in osteoblast-depleted fins. To investigate novel regulators of osteoblast dedifferentiation, we performed a genome-wide gene expression analysis of osteoblasts undergoing dedifferentiation. With this analysis, we concluded that this process occurs much earlier in the regenerative process than what was previously thought. Furthermore, we characterized the molecular basis of osteoblast dedifferentiation regarding epigenetic modulation, signal transduction, cell adhesion reorganization, epithelial to mesenchymal transition and acquisition of migratory behaviour and proliferation. Particularly, we observed that osteoblasts change their metabolic signature upon injury. This was predicted based on the upregulation of several glycolytic and lactate producing enzymes, which is followed by an increase in the expression of oxidative phosphorylation electron transport chain components. We hypothesize that osteoblast dedifferentiation relies on a bivalent metabolism that uses both glycolysis and oxidative phosphorylation, which may reflect an adaption to the energetic demands of regeneration. Since the link between metabolic adaptation and regeneration remains poorly understood, we decided to address it by inhibiting the glycolytic influx. We observed major defects in the regenerative process, including impaired assembly of the wound epidermis, a major signalling centre during regeneration, and fewer cells re-entering the cell cycle. In addition, we showed that several osteoblast markers were downregulated and that osteoblast populations became disorganized. This suggests that metabolic adaptation plays an important role in regeneration, in particular during osteoblast dedifferentiation. In addition to the transcriptional analysis, we followed a targeted approach. We examined the role of the Hippo signalling pathway as a potential regulator of osteoblast dedifferentiation, by inhibiting Yap (Hippo pathway effector). This prevented mature osteoblasts to migrate, re-enter the cell cycle and to assemble the osteoblast progenitor pool. In parallel, we evaluated the role of this pathway in mediating osteoblast redifferentiation during regenerative outgrowth. We noticed that Yap inhibition leads to a decrease in the number of differentiating osteoblasts and to the misregulation of key signalling pathways, such as Bmp and Wnt signalling. We provide evidence that Yap not only promotes osteoblast differentiation through activation of Bmp signalling via bmp2a expression but also restricts the osteoblast progenitor pool by inhibiting Wnt signalling to the differentiation front by regulating dkk1a. Altogether, these results lead us to propose that the Hippo/Yap signalling pathway regulates osteoblast dedifferentiation as well as redifferentiation. This reveals a previously unknown duality if the Hippo/Yap pathway in controlling two different aspects of osteoblast biology during caudal fin regeneration. Lastly, we provide evidence into the cellular and molecular mechanisms that regulate de novo osteoblast formation in osteoblast-depleted caudal fins. We identified an additional osteoblast progenitor population that arises at the outer and inner bone surfaces adjacent to the epidermal and mesenchymal compartments, respectively. These cells are not part of a uniform population but seem to form two distinct osteoblast progenitor populations with different origins or expression profiles. Lineage tracing experiments revealed that mesenchymal cells within the intraray compartment, but not epidermal cells, contribute to generate new osteoblasts in osteoblast-depleted caudal fins. This provides new evidence of an additional source of osteoblasts for regeneration. Moreover, we showed that both Retinoic Acid and Bmp signalling pathways are activated in this osteoblast progenitor population and are important to induce their commitment and recruitment during caudal fin regeneration. Thus, we elucidate potentially dormant regenerative mechanisms that emerge to ensure correct bone formation in caudal fins lacking mature osteoblasts. Taken together, this PhD thesis provides novel insights into new regulators of bone formation and alternative cells that can contribute to correct bone regeneration upon injury. We expect that defining the mechanisms regulating tissue plasticity, reprogramming and fate specification during bone reconstitution have major implications not only to understand the basic mechanisms that regulate tissue regeneration but also to the field of regenerative medicine and bone cancer biology.A regeneração é um processo biológico notável que permite a restituição de tecidos após lesão ou amputação, que incluí a recuperação da função, forma e tamanho do tecido original. Enquanto que os mamíferos possuem uma capacidade limitada de regenerar tecidos, outros vertebrados, como anfíbios e alguns peixes teleósteos, são dotados de uma capacidade extraordinária de regenerar órgãos, como o coração e a retina, e grandes superfícies corporais, como membros e barbatanas. O peixe-zebra (Danio rerio) é utilizado como modelo para o estudo de processos regenerativos em vertebrados. A barbatana caudal do peixe-zebra surgiu como uma das estruturas mais utilizadas para estudar regeneração. Esta estrutura é de fácil acesso à cirurgia de amputação, passível ao uso de técnicas de microscopia, não comprometendo a sobrevivência do animal, sendo que o seu processo regenerativo é consideravelmente rápido. A regeneração da cauda é um processo epimórfico, uma vez que depende da formação de uma estrutura especializada designada blastema. Esta estrutura é composta por uma população heterogénea de células com capacidade proliferativa. Após amputação da cauda, o programa regenerativo é caracterizado por três fases sequenciais: fecho da ferida, formação do blastema e, por fim, crescimento e diferenciação. Durante o processo regenerativo, a coordenação entre proliferação e diferenciação é de grande importância para assegurar e alcançar a estrutura e tamanho iniciais. A barbatana caudal é constituída por vários tecidos, incluindo vasos sanguíneos, nervos, tecido mesenquimal e tecido ósseo, este último sendo constituído por raios ósseos que providenciam estabilidade à cauda. Cada um destes raios ósseos é revestido externa e internamente por uma monocamada de células produtoras de osso, os osteoblastos. Muitos estudos têm-se focado na regeneração destes elementos ósseos presentes na barbatana caudal, uma vez que este sistema possibilita a compreensão do processo regenerativo do osso e a dinâmica dos osteoblastos neste contexto. Após amputação da cauda, a formação do novo tecido ósseo depende consideravelmente da plasticidade celular (alterações na identidade celular). Isto é alcançado durante a formação do blastema, através da ativação de dois processos complementares que permitem a formação de um conjunto de progenitores de osteoblastos: desdiferenciação de osteoblastos maduros presentes no tecido não danificado e diferenciação de progenitores presentes na zona da articulação. Posteriormente, mecanismos regulatórios mantêm e expandem o grupo de progenitores e promovem a sua diferenciação em osteoblastos completamente diferenciados, capazes de produzir matriz óssea e de reconstituir o tecido ósseo. Desta forma, a formação dos progenitores de osteoblastos assim como a sua correta diferenciação são essenciais para promover a regeneração dos raios ósseos da barbatana caudal. Curiosamente, a ablação de osteoblastos maduros antes do início do processo regenerativo não afeta a regeneração dos elementos ósseos, o que sugere que, neste contexto, que a sua formação depende unicamente de progenitores associados à articulação ou de fontes celulares alternativas ainda por descobrir. Durante esta tese de doutoramento, procurei elucidar aspetos chave da regeneração do osso da barbatana caudal do peixe-zebra, nomeadamente os processos regulatórios que controlam o programa de desdiferenciação dos osteoblastos maduros bem como a sua posterior diferenciação, e as fontes alternativas de progenitores de osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Com o intuito de investigar novos mecanismos regulatórios do processo de desdiferenciação, recorremos a uma análise global do transcriptoma dos osteoblastos nesta fase da regeneração. Esta análise revelou que o processo de desdiferenciação ocorre muito cedo durante o processo regenerativo. Para além disso, caracterizámos a base molecular do programa de desdiferenciação, no que diz respeito a mecanismos epigenéticos, metabolismo, vias de transdução de sinal, adesão celular, transição epitélio-mesênquima, migração e proliferação. Em particular, observámos que várias enzimas glicolíticas e produtoras de lactato exibem a sua expressão aumentada no início da desdiferenciação, seguidas de um aumento na expressão de componentes da cadeia transportadora de eletrões. Estes resultados demonstram que os osteoblastos alteram significativamente o seu metabolismo em resposta à amputação. Desta forma, propomos a hipótese de que a desdiferenciação dos osteoblastos depende da aquisição de um metabolismo bivalente no qual as vias glicolíticas e de fosforilação oxidativa são usadas para melhor adaptar os osteoblastos aos novos requisitos do processo regenerativo. Uma vez que a ligação entre adaptação metabólica e regeneração ainda está pouco explorada, decidimos investigar como é que o processo regenerativo é influenciado pela glicólise. Ao inibirmos o fluxo glicolítico, verificámos que o crescimento do tecido regenerativo é significativamente reduzido. Neste contexto, vários fenótipos foram observados: inibição da proliferação; desorganização da população de osteoblastos dentro do blastema; alterações na expressão de vários marcadores de osteoblastos; e deformação da epiderme especializada que se forma durante a regeneração, cuja função secretora de moléculas sinalizadoras é essencial para a desdiferenciação. Estes resultados sugerem que esta adaptação metabólica tem um papel importante durante a regeneração, em particular no processo de desdiferenciação. Para além da análise de transcriptoma, estudámos também uma via de sinalização em particular, a via Hippo, através da manipulação genética do seu efetor Yap. Descobrimos que a inibição de Yap durante a fase de desdiferenciação impede a migração e proliferação de osteoblastos maduros e a formação de novos progenitores. Para além disso, a inibição desta via durante a fase de rediferenciação leva a uma diminuição substancial dos osteoblastos em diferenciação e a uma alteração na expressão de componentes de vias de sinalização cruciais, bmp2 (via BMP) e dkk1 (via Wnt). Estes dados evidenciam que Yap promove a diferenciação dos osteoblastos através da ativação da via BMP e restringe o grupo de progenitores através da inibição da via Wnt. Estes resultados permitem-nos propor que a via de sinalização Hippo/Yap regula quer a desdiferenciação dos osteoblastos quer a sua subsequente rediferenciação, o que revela a dualidade do mecanismo de ação desta via em fases diferentes do processo regenerativo da barbatana caudal. Por último, revelamos a existência de mecanismos celulares e moleculares que regulam a formação de novos progenitores de osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Identificámos assim uma fonte adicional de progenitores que emerge na interface da matriz óssea com os tecidos adjacentes, nomeadamente a epiderme e o mesênquima. Estes progenitores não parecem formar uma população homogénea, mas sim duas populações distintas com diferentes origens ou com diferentes padrões de expressão. Recorrendo a técnicas de seguimento de linhagem, conseguimos identificar o mesênquima, mas não a epiderme, como uma fonte de novos osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Estes resultados põem em evidência uma origem adicional de osteoblastos que contribui para o processo regenerativo. Para além disso, demonstramos que as vias de sinalização do Ácido retinóico e Bmp estão ativas nesta população de progenitores e têm um papel crucial na formação e recrutamento desta fonte adicional de osteoblastos durante o processo regenerativo. Assim, este trabalho permite revelar que, em barbatanas caudais desprovidas de osteoblastos maduros, mecanismos regenerativos que se encontram normalmente inativos, são estimulados e asseguram a formação correta dos elementos ósseos neste contexto. De uma forma geral, esta tese de doutoramento identifica novos mecanismos de regulação da formação do tecido ósseo e fontes celulares alternativas que contribuem e garantem a correta regeneração do osso após lesão. Antevemos que o conhecimento dos mecanismos que regulam a plasticidade celular, reprogramação e especificação de linhagem durante a regeneração do osso possam ter implicações fulcrais não só para o conhecimento dos processos básicos que promovem regeneração, mas também no campo da medicina regenerativa e neoplasias

In silico analysis of molecular interactions between HIV-1 glycoprotein gp120 and TNF receptors

Proinflammatory microenvironmental is crucial for the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) pathogenesis. The viral glycoprotein 120 (gp120) must interact with the CD4+ T cell chemokine receptor (CCR5) and a co-receptor C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4) to let the virus entry into the host cells. However, the interaction of the viral particle with other cell surface receptors is mandatory for its attachment and subsequently entry. Tumor Necrosis Factor receptor type I (TNFR1), type II (TNFR2) and Fas are a superfamily of transmembrane proteins involved in canonical inflammatory pathway and cell death by apoptosis as responses against viral pathogens. In our study, we performed an in silico evaluation of the molecular interactions between viral protein gp120 and TNF receptors (TNFR1, TNFR2 and Fas). Protein structures were retrieved from Protein Databank (PDB), and Molecular Docking and dynamics were performed using ClusPro 2.0 server and GROMACS software, respectively. We observed that gp120 is able to bind TNFR1, TNFR2 and Fas receptors, although only the TNFR2-gp120 complex demonstrated to produce a stable and durable binding. Our findings suggest that gp120 may act as an agonist to TNF-α and also function as an attachment factor in HIV-1 entry process. These molecular interaction by gp120 may be the key to HIV-1 immunopathogenesis. In conclusion, gp120 may stimulate pro-inflammatory and apoptotic signaling transduction pathways mediated by TNFR2 and may act as an attachment factor retaining HIV-1 viral particles on the host cell surface.We acknowledge the financial support by the National Council for the Improvement of Higher Education – Brazil (CAPES) and the National Council for Scientific and Technological Development – Brazil (CNPq)

Portuguese recommendations for the use of methotrexate in the treatment of rheumatoid arthritis

Objectives:To develop Portuguese evidence-based recommendations for the use of methotrexate (MTX) in daily clinical practice in rheumatic disorders. Methods:The Portuguese project was integrated in the multinational 3E Initiative (Evidence, Expertise, Exchange) 2007-2008 where a total of 751 rheumatologists from 17 countries have participated. Ten clinical questions concerning the use of MTX in rheumatic diseases were formulated and the Portuguese group added three more questions. A systematic literature search in Medline, Embase, Cochrane Library and 2005-2007 ACR/EULAR meeting abstracts was conducted. Selected articles were systematically reviewed and the evidence was appraised according to the Oxford Levels of Evidence. In Portugal, a national meeting was held in Obidos on February 15 th and 16 th, 2008, involving 50 rheumatologists who discussed and voted by Dephi method the recommendations. Finally, the agreement among the rheumatologists and the potential impact on their clinical practice was assessed. Results: Thirteen national key recommendations on the use of MTX were formulated: work-up before starting MTX, optimal dosage and route of administration, use of folic acid, monitoring, management of hepatotoxicity, long-term safety, mono versus combination therapy, management in the perioperative period, during infections, before/during pregnancy and after clinical remission, screening and treatment of tuberculosis and the role of MTX as a steroid-sparing agent in rheumatic diseases. Discussion: The Portuguese recommendations for the use of MTX in daily clinical practice were developed, which are evidence-based and supported by a panel of 50 rheumatologists, enhancing their validity and practical use. This project was integrated in a multinational initiative that led to the recent publication of ten multinational recommendations which differ from ours in some specific aspects.publishersversionpublishe

Portuguese guide lines for the use of biological agents in rheumatoid arthritis - october 2011 update

The authors present the revised version of the Portuguese Society of Rheumatology (SPR) guidelines for the treatment of Rheumatoid Arthritis (RA) with biological therapies. In these guidelines the criteria for introduction and maintenance of biological agents are discussed as well as the contraindications and procedures in the case of non-responders. Biological treatment (with a tumour necrosis factor antagonist, abatacept or tocilizumab) should be considered in RA patients with a disease activity score 28 (DAS 28) equal to or greater than 3.2 des pite treatment with at least 20mg-weekly-dose of methotrexate (MTX) for at least 3 months or, if such treatment is not possible, after 3 months of other conventional disease modifying drug or combination therapy. A DAS 28 score between 2.6 and 3.2 with a significant functional or radiological deterioration under treatment with conventional regi -mens could also constitute an indication for biological treatment. The treatment goal should be remission or, if that is not achievable, at least a low disease activity, defined by a DAS28 lower than 3.2,without significative functional or radiological worsening. The response criteria, at the end of the first 3 months of treatment, are a decrease of at least 0.6 in the DAS28 score. After 6 months of treatment res ponse criteria is defined as a decrease greater than 1.2 in the DAS28 score. Non-responders, in accordance to the Rheumatologist's clinical opi -nion, should try a switch to another biological agent (tumour necrosis factor antagonist, abatacept, rituxi mab or tocilizumab).publishersversionpublishe

Characterisation of microbial attack on archaeological bone

As part of an EU funded project to investigate the factors influencing bone preservation in the archaeological record, more than 250 bones from 41 archaeological sites in five countries spanning four climatic regions were studied for diagenetic alteration. Sites were selected to cover a range of environmental conditions and archaeological contexts. Microscopic and physical (mercury intrusion porosimetry) analyses of these bones revealed that the majority (68%) had suffered microbial attack. Furthermore, significant differences were found between animal and human bone in both the state of preservation and the type of microbial attack present. These differences in preservation might result from differences in early taphonomy of the bones. © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved

NEOTROPICAL XENARTHRANS: a data set of occurrence of xenarthran species in the Neotropics

Xenarthrans—anteaters, sloths, and armadillos—have essential functions for ecosystem maintenance, such as insect control and nutrient cycling, playing key roles as ecosystem engineers. Because of habitat loss and fragmentation, hunting pressure, and conflicts with domestic dogs, these species have been threatened locally, regionally, or even across their full distribution ranges. The Neotropics harbor 21 species of armadillos, 10 anteaters, and 6 sloths. Our data set includes the families Chlamyphoridae (13), Dasypodidae (7), Myrmecophagidae (3), Bradypodidae (4), and Megalonychidae (2). We have no occurrence data on Dasypus pilosus (Dasypodidae). Regarding Cyclopedidae, until recently, only one species was recognized, but new genetic studies have revealed that the group is represented by seven species. In this data paper, we compiled a total of 42,528 records of 31 species, represented by occurrence and quantitative data, totaling 24,847 unique georeferenced records. The geographic range is from the southern United States, Mexico, and Caribbean countries at the northern portion of the Neotropics, to the austral distribution in Argentina, Paraguay, Chile, and Uruguay. Regarding anteaters, Myrmecophaga tridactyla has the most records (n = 5,941), and Cyclopes sp. have the fewest (n = 240). The armadillo species with the most data is Dasypus novemcinctus (n = 11,588), and the fewest data are recorded for Calyptophractus retusus (n = 33). With regard to sloth species, Bradypus variegatus has the most records (n = 962), and Bradypus pygmaeus has the fewest (n = 12). Our main objective with Neotropical Xenarthrans is to make occurrence and quantitative data available to facilitate more ecological research, particularly if we integrate the xenarthran data with other data sets of Neotropical Series that will become available very soon (i.e., Neotropical Carnivores, Neotropical Invasive Mammals, and Neotropical Hunters and Dogs). Therefore, studies on trophic cascades, hunting pressure, habitat loss, fragmentation effects, species invasion, and climate change effects will be possible with the Neotropical Xenarthrans data set. Please cite this data paper when using its data in publications. We also request that researchers and teachers inform us of how they are using these data